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生化與分子生物學研究技術  

2007-02-05 20:36:35|  分类: 專業工作 |  标签: |举报 |字号 订阅

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生化与分子生物学研究技术

试题解答

                                                                                                                     微生物专业  200511416

  

赵老师:学生因为目前还未做过太多分子方面的实验,所以前三道很有实践性的题学生只能通过从师兄师姐处问得的经验、网上搜的文献、书中翻到的资料作一比较汇总,解答如下:

1、克隆目的基因经常遇到的困难是什么?如何克服?

答:基因克隆中遇到的问题和困难,悉数恐难以穷尽,由于卷面所限,学生只能择其一二列如下:

1).回收不到目的片段,一般需要作什么对照实验?

A.涂布未转化的感受态细胞。如有菌落,表明氨苄失效,或污染上带有氨苄抗型的质粒,或产生氨苄抗型的菌落。

B.转化完整质粒,计算菌落生长数,测定转化效率。

C.如用pGEM-T正对照,或PCR产物,产生>20-40蓝斑,表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶(M1801M1804M1794)质量标准好无核酸酶污染,不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。

D.pGEM-TpGEM-T Easy载体,连接pGEM-T正对照,转化高频率感受态细胞(108次方)cfu/ug,按照指定的实验步骤,可得100个菌落,其中60%应为白斑,如产生>20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落,连接有问题。

2).对照结果好,却没有回收到目的片段,实验出了什么问题?

A.连接用室温保温1小时,能满足大多数克隆,为提高效率,需4℃过夜。

B.插入片段带有污染,使3`-T缺失,或抑制连接,抑制转化。为此,将插入片段和pGEM-T正对照混合,再连接。如降低了对照的菌落数,插入片段需纯化,或重新制备。如产生大量的蓝斑,插入片段污染有核酸酶,使pGEM-TpGEM-T Easy载体3`-T缺失。

C.插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段,因受UV过度照射,时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体,不利于连接,DNA必需重新纯化。

D.带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A,后者是pGEM-TpGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料(TM042)。

E.高度重复序列可能会不稳定,在扩增中产生缺失和重排,如发现插入片段高频率地产生缺失和重排,需用重组缺陷大肠杆菌菌株,如SURE细胞。

3).克隆PCR产物的条件如何最优?

11(插入片段:载体)常为最佳比,摩尔数比1881也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶,插入片段共10ul。室温保温1小时,或4℃过夜。在这2种温度下,缺T-凸出端的载体会自连,产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求,为提高连接效率,需4℃过夜。

4.PCR出现假阳性

  引物设计可能不合适,需重新设计引物。或者靶序列或扩增产物的交叉污染导致假阳性。可用以下方法解决:①操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样器内或溅出离心管外。②除了酶及其他不耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及进样枪头均应一次性使用。③必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR方法来减轻或消除。

5.出现非特异性扩增带

  非特异性条带的出现,其原因:一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关。三是酶的质和量。其对策有:必要时重新设计引物。降低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸)

6.出现片状拖带或涂抹带

  PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带,往往由于酶的量过大或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。其对策有:①减少酶的量,或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓 度。④增加模板量,减少循环次数。

2、表达目的基因经常遇到的困难是什么?如何克服?

答:基因表达实际操作中的困难也是或大或小、形形色色,现举例如下:

1.重组蛋白在宿主系统中高水平表达时,无论是原核表达体系或真核表达体系甚至高等真核表达体系,都会形成包涵体。如何减少包涵体形成?

A.降低重组菌的生长温度,以降低无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用,从而可减少包涵体的形成。

B.添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂,培养E.coli时添加高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖可以阻止分泌到周质的蛋白质聚集反应。其它促重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂还有乙醇(诱导热休克蛋白的表达)、低分子量的巯基或二硫化合物(影响细胞周质的还原态,从而影响二硫键的形成)和NaCl

C.供给丰富的培养基,创造最佳培养条件,如供氧、pH等。

2.该如何提高重组蛋白质折叠复性?

最传统也是应用最普遍的蛋白质折叠复性方法有三种:透析、稀释和超滤复性法。但回收率都较低,除此之外还有:高蛋白浓度下的复性方法,添加促进剂的复性方法,液相色谱(LC)复性法,反胶束复性法和双水相复性法。

3.该如何提高包涵体蛋白的复性产率?

对于含有二硫键的蛋白,复性过程应能够促使二硫键形成。常用的方法有:空气氧化法、使用氧化交换系统、混合硫化物法、谷胱甘肽再氧化法及DTT再氧化法. 低分子化合物自身并不能加速蛋白质的折叠,但可能通过破坏错误折叠中间体的稳定性,或增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产率。如盐酸胍、脲、烷基脲、以及碳酸酰胺类等。PEG-NaSO4两相法及分子伴侣和折叠酶等亦常用。提高复性率的策略还有许多,如:非离子型去垢剂,尤其是离子型或两性离子去垢剂或表面活性剂Triton X-100、磷脂、等对蛋白质复性有促进作用;待折叠复性的蛋白质的抗体可有效协助其复性;多聚离子化合物如肝素不仅可以促进蛋白质的作用,而且具有稳定天然蛋白质的作用。

4.如何鉴定细菌超声破碎的程度? 

最简单的方法:涂片--革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟---显微镜观察。而且只用结晶紫染色,染色后再用水稍冲洗一下。

5.GST融合蛋白形成包含体不溶怎么办?

GST融合蛋白应该不能用尿素等作用太强的变性剂,否则GST融合蛋白是不能与beads相结合的。GSTBeads是应用酶与底物结合的原理,所以要去除处理因素后才好结合。做完裂解之后加Triton X100轻摇30min,蛋白溶解的会多些!

6.复性中蛋白析出的对策?

出现蛋白析出,肯定是条件变化太剧烈了。复性应该采取复性液浓度和PH值逐渐变化的方法,例如根据包含体的溶液成分,每隔1PH或浓度值配置一种溶液,逐步透析到正常。此外透析时必须浓度极低,条件温和,使蛋白质能够正确折叠。但是复性的比率应该很低。 

若加变性剂尿素可加到2M,盐酸胍可加到1-1.5M;另外可将甘油浓度增加,范围可在≤30%,且在复性样品中也可加适量甘油。

3、可以用哪些方法研究基因功能?简述这些方法的基本步骤。

答:目前对基因功能的研究方法,学生个人认为可大致归纳为以下几个层次:

1.基因水平:通过基因突变的方法是目前最基本的研究方法,常见的就是基因敲除,又分Knock in Knock up。具体的实验方法有:同源重组(单交,双交),转座子Tn(原核),农杆菌介导(双元载体)等(常规技术具体操作不再赘述)。

    在转座子研究方面,我国复旦大学发育生物学研究所许田博士和吴晓晖博士共同领导的研究小组将一种源于飞蛾的PB转座因子用于小鼠和人类细胞的基因功能研究,在世界上首次创立了一个高效实用的哺乳动物转座因子系统,为大规模研究哺乳动物基因功能提供了新方法。该成果刊登在05812日《细胞》杂志的封面。另外加州大学的HHMI霍德华修斯医学院研究员Jonathan  S.  Weissman和他的同事,利用epistatic  mini  array  profiles  (简称为E-MAP)  的方法可以找到已知基因的新功能、未知蛋白的功能,以及确定生化过程和蛋白质之间的相互作用(2005114日的Cell)。

2.转录水平:对策仍然是屏蔽基因的正常功能影响生物体的生长发育,只不过用的是RNA干扰或反向RNA等技术干扰转录水平。

3.蛋白质水平:对于较为简单的单基因,也可以用简单的方法:将已有基因在合适表达系统中表达,然后用酵母双杂交等的方法检测表达蛋白的相互作用,反推基因功能。

4.表征水平:一类是传统的从突变表型出发,比如人类家族病,然后通过扣除杂交等技术反找到基因。扣除杂交法分离缺失突变基因:从野生型植株制备的染色体总DNA,用一种适当的核酸内切限制酶[比如Sau3A]切割成小片段。同时从缺失突变体植株制备的染色体总DNA,经随机切割之后,用生物素(biotin)进行标记,供作非同位素标记探针使用。取大大超量的此种探针,同Sau3A酶切的野生型染色体总DNA片段混合,经变性、退火处理,溶液中的无生物素标记的野生型的DNA分子便同生物素标记的突变型的DNA探针杂交。将杂交反应混合物通过生物素结合蛋白质柱(avidincolumn)。这种柱是用包裹着生物素结合蛋白质的专用的细小磁珠装填的。大部分野生型植株的DNA分子都同突变型植株的生物素标记的DNA探针杂交,便被结合到柱上。而野生型植株的DNA片段,由于在突变型DNA中缺失了相应的片段,故没有相应的生物素标记的探针与之杂交,经洗脱便过柱流出。随后将洗脱收集的DNA同超量的生物素标记探针再杂交,再过柱。如此经过多次重复富集之后,用PCR法扩增DNA片段,并予以克隆。最后用Southern杂交法进一步鉴定出,只同野生型DNA杂交而不能同突变型DNA杂交的含有突变基因的阳性克隆。

    另外最近苏格兰邓迪大学生命科学院细胞和发育系的研究员乔纳森丘伯博士,与纽约的研究者合作,运用一个功能极其强大的显微镜来观察活细胞的内部,他们采用一个荧光标记,当基因处于活化状态时,这个标记将与基因融合在一起。在显微镜下,这个荧光标记显示为一个亮点。这个亮点时隐时现,如此反复,显示出单个基因开启和关闭的过程。他们的成果已刊出在2006523日出版的《当今生物》(Current Biology)上。

5.生物信息学:若拿到基因序列,首先应在基因库中作序列比对,同源性分析,预测基因功能。

4 蛋白质纯化的策略是什么?请设计一条从动物组织纯化蛋白质的技术路线(含方法)。

答:蛋白质提纯的总目标是设法增加制品纯度或比活性,对纯化的要求是以合理的效率、速度、收率和纯度,将需要蛋白质从细胞的全部其他成分特别是不想要的杂蛋白中分离出来,同时仍保留有这种多肽的生物学活性和化学完整性。

    蛋白质纯化的基本原则是首先尽可能的了解目的蛋白的物化性质,其次了解最终产品用途从而设计纯化过程,最后充分了解各分离纯化单元的信息。过程优化使蛋白质纯化后收率、纯度最高,成本最低。主要步骤通常不超过四五个:细胞分离,细胞破碎(对胞内蛋白而言),浓缩,预处理或初步分离纯化,高效分离纯化。

    纯化蛋白,必须首先大量搜集阅读相关文献,掌握目的蛋白的相关信息。此处因时间所限,学生只能假设,待纯化的蛋白样品是位于动物肝脏细胞内一可溶性的蛋白酶,现设计纯化方案如下:

一,材料取得:材料应尽量新鲜,可以联系屠宰场取得猪肝,若实在来不及可以-20度冷藏。材料取得后应先进行脱脂处理,防止酸败和利于后续处理。

二,细胞破碎:常用破碎方法有研磨法,组织捣碎器法,超声波法,压榨法,冻融法,溶胀和自溶,化学处理,生物酶解法等。此处据实验室条件选用组织捣碎器法,后离心,缓冲液抽提。若有必要,添加合适的抑制剂。

三,样品浓缩:常用方法有吸附法,超滤法,沉淀法,透析法,冷冻干燥法,双水相分离法。此处用超滤后透析脱盐。

四,离子交换色谱:根据相关性质选择阴阳交换剂类型,合适的缓冲体系和盐浓度等,然后在实验中摸索优化,电泳检测纯度。设目的蛋白在洗脱液中,且仍有杂质。

五,凝胶过滤色谱:根据目的蛋白的大小等相关性质选择合适的凝胶介质、缓冲体系和色谱条件。一般来说,选择合适的凝胶过滤即可达到电泳纯,若实在还不行,可以考虑进行以下实验:

六,亲和色谱/共价色谱/电泳纯化等:以亲和色谱为例,其是利用蛋白分子的生物学活性进行分离,具有高度选择性,同时起到浓缩的作用。选择合适的配体等条件,一般可以得到高纯的目的蛋白。

    以上每分纯步骤须进行电泳检测纯度,且须按下表计算得率和纯化倍数:

步骤

总蛋白/g

总活力/u

比活力/(u/mg)

纯化倍数

回收率/%

 

 

 

 

 

 

纯化倍数=每步比活力/粗抽提液的比活力;回收率=每步总活力/粗抽提液总活力×100

视纯化倍数的大小,回收率的高低,初步评价每步分离方法的价值。

总蛋白测定选用Lowry法。

 另外,拿到纯品后一般需要做酶学性质测定,基本的蛋白分子量测定、等电点测定、纯度分析、N末端测序等后续工作。

 

 

 

 

                                                        2006.06.28

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