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日志

 
 

革兰氏染色方法及原理  

2008-03-05 15:34:19|  分类: 專業工作 |  标签: |举报 |字号 订阅

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基本原理

  革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法(Gram stain)不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类:染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌,用G+表示;染色反应呈红色(复染颜色)的称为革兰氏阴性细菌,用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应,是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的,在染色过程中,当用乙醇处理时,由于脱水而引起网状结构中的孔径变小,通透性降低,使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色,因此,呈现蓝紫色;革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低,而脂类物质含量高,当用乙醇处理时,脂类物质溶解,细胞壁的通透性增加,使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色,然后又被染上了复染液(番红)的颜色,因此呈现红色。

  革兰氏染色需用四种不同的溶液:碱性染料(basic dye)初染液;媒染剂(mordant);脱色剂(decolorising agent)和复染液(counterstain)。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样,而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫(crystal violet)。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力,即以某种方式帮助染料固定在细胞上,使不易脱落,碘(iodine)是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色,不同类型的细胞脱色反应不同,有的能被脱色,有的则不能,脱色剂常用95%的酒精(ethanol)。复染液也是一种碱性染料,其颜色不同于初染液,复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色,而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色,从而将细胞区分成G+G-两大类群,常用的复染液是番红。

  三、器材

  大肠杆菌,枯草芽孢杆菌;

  革兰氏染色液,载玻片,显微镜等。

  四、操作步骤

  1.涂片将培养14—16小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片(注意涂片切不可过于浓厚),干燥、固定。固定时通过火焰1—2次即可,不可过热,以载玻片不烫手为宜。

  2.染色

  (1)初染 加草酸铵结晶紫一滴,约一分钟,水洗。

  (2)媒染 滴加碘液冲去残水,并覆盖约一分钟,水洗。

  (3)脱色 将载玻片上面的水甩净,并衬以白背景,用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止,约20—30秒钟,立即用水冲净酒精。

  (4)复染 用番红液染1—2分钟,水洗。

  (5)镜检 干燥后,置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色,革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准,过于密集的细菌,常常呈假阳性。

  (6)同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片,作革兰氏染色对比。

  革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度,如脱色过度,则阳性菌可被误染为阴性菌;而脱色不够时,阴性菌可被误染为阳性菌。此外,菌龄也影响染色结果,如阳性菌培养时间过长,或已死亡及部分菌自行溶解了,都常呈阴性反应。

 

 

革兰氏染色是用来鉴辨细菌的一种方法,细菌细胞壁上的主要成分不同,利用这种染色法,可将细菌分为两大类。这种染色法是由一位丹麦医砟汉斯‧克里斯蒂安‧革兰(1853年-1938年)1884年所发明,最初是用来鉴别肺炎球菌与堋雷白氏肺炎菌之间的关系。革兰氏染色的对象是细菌的细胞壁。染色后的细菌可在显微镜下更好的观察,以便于区分。该染色法是以丹麦医生和细菌学家汉斯‧克里斯蒂安‧格兰的名字命名的,他在19世纪末发展出这一方法。不同的细菌在该染色法的作用底下反应不同,借以区分成为两类。

两类细菌对抗生素的反应并不一样。通过抽取样品医生可以在很短的时间内(5分钟左右)确定细菌的格兰氏性质。这样,医生就可以快速的给病人注射抗生素,而不需要等待通过细菌培植得到的化验结果,这往往需要几天时间。

染色流程

流程可概括为:染色-脱色-复染。 第一步初染剂(Primary Stain):使用结晶紫染色。 第二步媒染剂(Mordant):加入复方碘溶液 或称革兰氏碘液(Gram's Iodine)后会形成不溶性的结晶紫-碘( V-I)复合体。细菌呈紫黑色。第二步最关键,它的目的是分辨细菌的革兰氏染色特性。若为革兰氏阳性菌,此复合体系结合于细胞壁之镁、核糖核酸组成(Magnesium Ribonucletic Acid),形成镁-核糖核酸-结晶紫-碘( g-RNA-CV-I)复合体,不易脱去。第三步脱色剂(Decoloring Agent):使用酒精(95%)脱色,试剂堷脂溶剂(Lipid Solvent)和蛋白脱水剂(Protein Dehydrating Agent)之双重功能。此步骤对革兰氏阳性细菌无效,因为细胞壁上厚厚的 细胞壁 层阻隔了结晶紫-碘复合体的外渗,只留在细菌体内。革兰氏阴性菌细胞壁薄,会被脱色而成为无色。 第四步复染剂(Counterstain):为了对比,在此后会加入番红(Safranin)进行复染,格兰氏阴性菌成红色,而革兰氏阳性菌保有原来的紫色。

实验方法

药品

结晶紫:作为初染剂

碘液 :作为媒染剂

酒精 :浓度为95%,作为脱色剂

番红:复染剂

实验器材

实验菌种、接种环、蒸馏水、玻片、 精灯、吸水纸、光学显微镜

实验步骤

将菌种抹于玻片上,并置于酒精灯上以热固定。

用洗水纸将多余的水吸干后,即可置于显微镜下观察。

注意事项:

将碘液滴于玻片上,静置一分钟后,用蒸馏水洗去多余的碘液。

酒精脱色,直至无结晶紫的颜色流出为止。

以番红复染,约45秒后用蒸馏水洗去。

将结晶紫滴于玻片上,静置一分钟后用蒸馏水洗去多余的结晶紫。

以酒精灯烘干玻片时,应避免热源持续对同一点加热,以免玻片破掉。

以蒸馏水洗去多余药品时,应避免直接冲洗到样品的位置,可将玻片与水平面呈一个角度,使蒸馏水由玻片较高处向样品处流去。

此实验的标准作法应于无菌的状态下操作。

本实验可以大肠杆菌和金黄葡萄球菌作为控制组。

实验结果

革兰氏阳性菌呈现紫色,或更深的蓝紫色。

革兰氏阴性菌呈现粉红色或红色。

定性

KOH-试验

另外的一种方法是氢氧化钾试验。将培养好的细菌取出一小部分使其悬浮于一滴KOH溶液中。格兰氏阳性菌与之不发生反应,用细针穿过该溶液,溶液呈正常液体状。格兰氏阴性菌壁太薄,无法抵抗碱液的侵蚀。细菌壁被破坏,DNA溢出,溶液粘性上升。用细针穿过溶液,可以看到溶液中布有丝状物质。

氨 试验

除了个别例外,只有格兰氏阴性菌才能证明氨的存在。这是该试验的基础。将要进行试验的细菌放入试管加氨。放入一张显示活性的试纸,在37 C下等待10到35分钟,试纸变成深黄色。

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