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青山妩媚

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日志

 
 

第一章 绪言1  

2008-04-12 13:41:47|  分类: 毕业论文 |  标签: |举报 |字号 订阅

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第一章  绪 言

 

1.褐藻酸的研究进展

1.1 褐藻酸发现史

褐藻酸(algin), 国内文献中称谓不尽相同,对其定义也稍有出入,已报道有:褐藻酸、褐藻胶、褐藻糖胶、海带胶、海藻酸、海藻藻酸、藻酸等。1881112日,苏格兰化学家E.C.C.Stanford在其发布的专利中首次提到褐藻酸。他研究当时在浅海大量繁殖的大型藻(Ascophyllum)的化学成分,用碳酸钠溶液提取藻体,然后用盐酸调节液体到酸性时,观察到液体出现了纤维状的固体物质,这就是最初发现的褐藻酸(Stanford, 1881)1883年后又对他的发现做了进一步研究(Standford, 1883a, b)1926年两个实验室在Stanford预测褐藻酸含有氮的基础上,各自发现糖醛酸是其结构物质(Atsuki, 1926; Schmidt, 1926)。之后几个研究小组都在褐藻酸盐水解物中发现了D-甘露糖醛酸,糖醛酸残基之间靠β-1,4-键连接(Nelson, 1929, 1930, 1932; Bird, 1931; Miawa, 1930; Hirst, 1939)。原本以为简单的褐藻酸组成模式却被FischerD?rfel(1955)打破。他们在对糖醛酸和聚糖醛苷的纸层析研究中发现褐藻酸水解物中大量存在一种全新的糖醛酸——L-古罗糖醛酸,并且建立了定量测定甘露糖醛酸和古罗糖醛酸的方法。自此褐藻酸被认定是由β-D-1,4-甘露糖醛酸(β-D-mannuronic acid简称M)α-L-1,4-古罗糖醛酸(α-L-guluronic acid,简称G)两种残基组成的二元共聚物。Haug及其合作者检测了不同来源的褐藻酸的糖醛酸组成,并且建立了褐藻酸的化学分离方法(haug, 1964)。后来细菌合成的褐藻酸以及将甘露糖醛酸转化为古洛糖醛酸的系列差向异构酶等的发现,也不断完善着人们对褐藻酸的理解。

1.2 褐藻简介

褐藻门(Phaeophyta)约有250属,1500种,绝大部分海产,营固着生活,产于淡水的仅10种左右,其中有两种在我国嘉陵江中发现。多分布于寒带和温带水域,在南极和北极海岸占优势地位,但有个别物种如马尾藻和网地藻为暖海性物种。其植物体均由多细胞构成,结构也比较复杂。褐藻门是藻类植物中较高级的一个类群,褐藻植物体均为多细胞体,简单的是由单列细胞组成的分枝丝状体;进化的种类,有类似根、茎、叶的分化,其内部构造有表皮、皮层和髓部组织的分化,甚至有类似筛管的构造。细胞壁分两层,内层由纤维素组成,外层由褐藻胶组成。载色体1至多数,粒状或小盘状,含叶绿素ac、胡萝卜素及数种叶黄素(主要是墨角藻黄素)。由于叶黄素的含量超过别的色素,故藻体呈黄褐色或深褐色。贮藏物质为褐藻淀粉(laminarin)、甘露醇(mannitol)和脂类等。褐藻中最大的为巨藻(Macrocytis),藻体可长达60多米。有的种类如海带,细胞内含有大量碘。营养细胞均无鞭毛,游动抱子和雄配子具有两条侧面不等长的鞭毛,繁殖的方式有多种,都能行有性生殖,在生活史中多有明显的世代交替,常见而且作食用的有海带和裙带菜。

我国海域辽阔,褐藻资源丰富,沿海常见的褐藻种类有: 铁钉菜、鹿角菜、昆布、裙带荣、马尾藻、海带等。马尾藻是热带及温带的藻类,我国南方的种类和数量都比北方多,据调查马尾藻的数量海南省最多,年产干藻约1万多吨,约占全国其它地区产量的一半。我国的褐藻除马尾藻外,主要分布于北方沿海。据《中国海洋年鉴》记载,我国2000年海藻产量达到1,221,988 t (干重),占海水养殖总量的11.5%,占世界海藻栽培年产量的2/3以上,创造了巨大的生态效益、社会效益和经济效益(张学成等,2004)

我国民间早有采用海藻的习惯,或食之以腹,或入药治病,海藻也被称为海中森林”(曾成奎)。海藻入药已有1000多年历史,我国中医发现在东海生长的叫做昆布(又称作海带)的褐藻,有治疗甲状腺肿大的功效,仅《本草纲目》中就收录了海洋药物101种。中国古代的昆布指的是海带目(Laminariales)翅藻科(Alariaceae)昆布属(Ecklonia)的昆布(Ecklonia kurome)

海带属(Laminaria)属于不等世代纲海带目。孢子体大,长达14米,分固着器、柄和带片三部分。固着器呈分枝的根状,把个体固定于岩石等基物上;柄粗短呈叶柄状;带片扁平,无中脉,是人们食用的部分。柄和带片组织均分化为表皮、皮层和髓3个部分。髓部中央有筛管状的喇叭丝,具有输导有机养料的功能。海带(L. japonica)是经济褐藻,原分布于苏联远东地区、日本和朝鲜北部,是一种大型定生海藻。20世纪30年代从日本北海道引进,最初我国只有辽东半岛、胶东半岛的很小部分海区,适宜海带自然生长,因此,产量很低。从50年代初开始,在曾成奎等老一代生物学家带领下,我国科研人员开始了人工养殖海带的研究,相继开发了海带自然光,低温育苗以及浮垡式养殖和施肥技术,解决了海带下苗培育,施肥和难以养殖的难题,从而使海带人工养殖业从无到有,迅速发展。现不仅在我国渤海湾地区,在长江以南浙江舟山地区和江苏、福建、广东等省沿海也有大量栽培。我国的海带也从几十年前的进口到现在年产量占世界年总产的一半以上,我国也成为世界第一大海藻养殖国家。

1.3 褐藻酸结构组成

褐藻酸是主要从海带、马尾藻、巨藻等褐藻中提取的非支链多糖聚合物,是褐藻细胞壁和细胞间质的主要组成成分,也是褐藻中含量最多的一种多糖,占褐藻干重的40%,其分子是由β-D-甘露糖醛酸(M)α-L-古罗糖醛酸(G)两种残基以多样性的排列方式由1,4-键连接而成[1]。经部分酸水解发现其分子中存在三种模块: 均聚甘露糖醛酸片段(Poly-mannuronatePM)、均聚古罗糖醛酸片段(Poly-guluronatePG)和甘露糖醛酸-古罗糖醛酸杂合片段(MG-block)(Haug, 1964, 1965, 1966, 1967a)PMPG的链式结构非常相似,单糖组分的区别仅在C-5上羟基位置的不同,但当其成环后,尤其是进一步聚合成链后的空间结构,则差别非常大。溶液的黏度数据表明各模块的劲度为MG<PM<PGLarsen(1970)提出在不足以完全确定褐藻酸序列结构的情况下,对其大致的描述可能需要用到二级Markov模型。褐藻酸同时还作为某些土壤细菌和动物病原菌的荚膜多糖,主要产生于两个异养细菌家族:假单胞菌(Pseudomonadaceae)和固氮菌(Azotobacteriaceae)。而细菌来源的与海藻的褐藻酸在分子水平上的关键不同在于前者在C2/C3位置处有O-乙酰基团存在(Skj?k-Br?k, 1986; Sutherland, 1995)。乙酰化影响了高聚物的水结合特性对离子结合的选择性以及降解的敏感性(Wong, 2000)

Atkins(1970)通过X射线衍射技术研究发现,古洛糖醛酸残基在均聚模块中呈现1C4构象,而甘露糖醛酸残基呈现4C1构象[1-1(a)]。关于褐藻酸结构的详细信息,可以通过1H13C高分辨率NMR进行序列分析获得(Grasdalen, 1977, 1979, 1983; Penman, 1972)。褐藻酸含所有可能的四种糖苷键:双平伏键(diequatorial, MM)、双直立键(diaxial, GG)、平伏-直立键(equatorial-axial, MG)以及直立-平伏键(axial-equatorial, GM)[1-1(b)]PG模块中的双直立键阻碍了围绕糖苷键的旋转,这可能造就了褐藻酸链的刚性和伸展性(Smidsr?d, 1973)

褐藻酸本质是多糖,类似于合成高聚化合物,在分子量上市多分散性的,而不同于其他生物大分子比如蛋白质和核酸。所以褐藻酸的分子量指的是全部分子量分布的平均值。整个褐藻酸分子平均分子量可达3.2万~18.6万道尔顿。分子量分布对褐藻酸的应用具有重要意义,尤其在一些高技术应用领域,一旦缺少PM模块可能导致褐藻酸凝胶出现问题(Stokke, 1991; Otterlei, 1991)

       1-1 褐藻酸盐结构特征 a. 褐藻酸单体;b.褐藻酸构象;c.模块分布

1-1 藻类褐藻酸盐组成和序列参数(Smidsr?dDraget, 1996

不同来源的褐藻酸结构和组分差异很大。商业出售的褐藻酸主要来源于北极昆布(Laminaria hyperborea)pyrifera大囊伞(Macrocystis pyrifera)、掌状昆布(Laminaria digitata)、泡叶藻(Ascophyllum nodosum)、糖海带(Laminaria japonica)Eclonia maximaLessonia nigrescensDurvillea antarctica和马尾藻属(Sargassum spp.)。这些样品的序列参数已由高场NMR测定[1]。我国以海带生产的褐藻酸M/G比值在2.26左右,而马尾藻褐藻酸中M/G比值在0.8-1.5(纪明候,1997)。细菌中可以分离到完全为甘露糖醛酸组成的褐藻酸(Valla, 1996),而北极昆布老叶柄的外表皮中则可以分离到古洛糖醛酸占绝对优势的褐藻酸[1-1]。同一藻体不同组织部位的褐藻酸结构和组分差异也很大。如在海带,按M/G比值大小顺序为基部>中部>尖部。生长在裸露海岸区域的北极昆布,具有较大机械强度的叶柄和根部含有大量的古洛糖醛酸,而漂浮在水流中质地柔韧的叶片中则G组分很低。另外同一藻体随着季节和生长环境的变化其褐藻酸结构和组分也在发生相应的变化(Haug, 1964; Indergaad, 1987)所以通常认为褐藻酸的生物学功能是结构成形,细胞间的褐藻酸基质赋予了藻体机械强度和韧性(Andresen, 1977)。而病原菌等细菌荚膜中的褐藻酸组分则可以形成生物膜(biofilm)大大增强细菌毒力和对抗生素及不利环境的抵抗力(Richard, 1998)。从维涅兰德固氮菌中分离到的甘露糖醛酸C-5位异构酶可以将高聚物中的M转变为G,对褐藻酸实施体外酶促修饰,使得生产在化学组成和序列上呈现高度程序化的具有特定理化特性的褐藻酸盐成为可能(Ertesv?g, 1995, 1998b; H?ydal, 1999)

1.4 褐藻酸理化特性

褐藻酸盐的溶解度主要受溶液pH值和总离子强度的影响。溶液pH决定了糖醛酸残基上静电荷的存在。Haug(1964)滴定了MG单体的解离常数分别为3.383.65。褐藻酸高聚物的pKa值与两种单体只是稍有不同。pH值高于pKa越远,必然越利于褐藻酸盐的溶解;pH值突然降至pKa以下便会导致褐藻酸盐的沉淀,缓慢并处于控制下的质子释放可以形成藻酸凝胶PMPG模块的增多会使得褐藻酸盐更容易析出,相比之下含有较多MG模块的褐藻酸会在较低的pH值下沉淀。由于褐藻酸盐在低pH值下溶解度相对有限,藻酸丙二酯(propylene glycol alginate, PGA)可用作酸性条件下的食物稳定剂。

褐藻酸含有游离羧基,性质活泼,溶液中离子强度的变化很大的影响了高聚物链的延展和溶液的黏度。褐藻酸在纯水中几乎不溶,为无色非晶体,也不溶于乙醇、四氯化碳等有机溶剂。褐藻酸能与蛋白质、蔗糖、甘油、淀粉、磷酸盐类共溶,能和一价金属离子(Na+K+NH4+)Mg2+Hg2+成盐,呈黏稠状胶液,而酸的除镁和汞之外的二价盐和三价盐(Ca2+Al3+Ba2+盐等)不溶于水。在像氯化钾等的高浓度无机盐存在下会出现很强的盐析效应,褐藻酸盐会断裂并析出(Haug, 1967, 1959a)。褐藻酸盐结合水与溶剂水之间的化学电位势很可能是其在水中溶解的驱动力,该化学电位势是由微环境中高浓度的相反电荷所致。当水相溶液中已经含有离子时,这种驱动力强度便显著降低。如果要在高盐浓度下应用褐藻酸盐,应该先将高聚物在纯水中彻底水合,然后再在剪力作用下加入盐(S.De贝特斯,生物高分子)

褐藻酸盐作为线性高聚物,容易受到各种解聚作用的影响。在pH值接近中性时褐藻酸盐的降解最少,随着pH值向两个方向发展,其降解度也相应增加,溶液黏度随pH 的变化整体成一倒钟形曲线。pH小于5或大于10,其降解速率明显加快。pH值低于5时的降解加剧是因为质子催化水解,而高于10时的不稳定性增加则缘于β-烷氧基的去除(Haug et al., 1963, 1967b)。解聚作用会随着温度的升高而增强,一般而言,60 ℃以下比较稳定。通常建议以过滤除菌而不是高温高压灭菌的方式处理褐藻酸盐溶液。褐藻酸盐干粉的除菌也比较麻烦,γ射线的照射往往是不可逆毁坏性的,通常干品需要避光保存。

褐藻酸盐分子的主要物理性质在20世纪70年代前已经基本被揭示,最近几十年的研究热点主要集中在其凝胶形成上。与其他凝胶性多糖相比,褐藻酸最令人兴奋的特性是与多价阳离子结合的选择性(Haug, 1964, 1970; Smidsr?d, 1968b, 1973, 1974),这也是凝胶形成的基础,而且褐藻酸盐液态/凝胶态之间的转换不受温度的影响。高聚物中G含量的提高可显著增强与某些碱土金属离子(例如Ca2+相对于Mg2+而言的强结合及协同结合)之间高度选择性的结合,而PMMG模块几乎没有选择性,说明PM模块的结构性质导致一些螯合作用。Grant(1973)试图通过基于古洛糖醛酸连接构象的卵盒”(egg-box)模型来解释。该选择性也依赖于藻酸盐凝胶的离子组成,对特殊离子的亲和性随凝胶中离子含量的升高而增加,如褐藻酸钙凝胶与褐藻酸钠凝胶相比对Ca2+具有更高的亲和力(Skj?k-Br?k, 1989b)。褐藻酸与多价阳离子迅速且不可逆的结合反应,使得这两种成分直接混合则形成分散的鱼眼状胶体乳突(fish-eyes)。褐藻酸盐可以加热却不融化,所以可以用于焙制乳酪制品。褐藻酸离子交联凝胶的制备不怎么依赖于温度,是冷制的。褐藻酸钠凝胶在卫生学及医药应用中可作为良好的吸水剂。另外褐藻酸盐在低于pKa值的条件下会形成酸性凝胶,在pH值低于2.5时酸性凝胶的凝胶强度不再受pH值影响。酸性凝胶的形成对高含量的G模块和高分子量有明显的依赖性(Draget, 1994)

  1.5 褐藻酸应用及市场

海洋生物生活在一定水压、较高盐度、较小温差、有限溶氧,有限光照的海水化缓冲液体系中,特殊的生活环境导致海洋生物体内多糖的合成过程与陆地生物有很大不同,并产生许多结构新颖作用特殊的活性物质,使其常具有显著的药理稳定性和保效性,已成为开发新药特药的主要方向之一。褐藻胶和琼胶、卡拉胶并称海洋三大多糖,是海洋给人类的无私馈赠,因市场多以其钠盐出售,故市场所称褐藻胶通常是指褐藻酸钠,为乳白色或淡黄色固体颗粒或粉末。褐藻酸钠的分类方法较多,从结构上分,可分为高G/M比、中G/M比、低G/M比三种;从黏度上分,可分为低黏度、中黏度和高黏度海藻酸钠;从纯度上分,可分为工业用,食用以及医用三个级别。目前商业化的褐藻酸盐仍然都是从海藻中提取的,应用领域从传统技术应用到食品再到生物医药,其应用也主要基于保持水分、凝胶性能、增稠黏化和固着稳定的物理特性。

工业中最主要的是作为织物印染业中剪切-稀化的增黏剂,优于淀粉和其它浆料,可获得高着色率、明亮的色泽和良好的层次感,特别对活性染料效果更佳,手感好、易洗浆,现已广泛用于棉布、羊毛、丝及尼龙织品的印花。造纸工业上代替部分松香作为纸浆分散剂或纸张表面上浆剂,能增加光泽和光滑度,使纸的表面显得均匀,并提高纸的耐揉性;在焊条的生产中用作结合剂;还经常用于罐头的封边;还可用作农药的稳定剂,肥料成型剂、调节剂等;在轻工业方面,固定各种菌种和酶制剂, 进行连续发酵、酶解,从而大大提高生产率;还可以用作橡胶膏化剂、硬化软化剂、牙膏、牙粉、洗涤剂的增稠剂、发泡剂、农药分散剂、照相胶片膜、海水淡化半透膜、食品包装膜等。此外,也广泛应用于日用化工、橡胶、冶金、建筑、石油、废水处理等各个领域。

作为食品黏结剂、增稠剂、乳化剂、稳定剂被广泛应用于面食、冰激淋、仿生食品、奶酪、饮料等产业,被人们称之为奇妙的食品添加剂、长寿食品等。如用褐藻酸钠作冰激凌等冷饮食品的稳定剂,能使冰粒细腻,不易溶化,并能防止冰粒在贮存期间变粗;作牛奶的稳定剂,可防止牛奶中的不溶物沉淀:用于糖果的生产,能使软糖增大透明度和拉力,口感细腻;能使巧克力提高乳化稳定生,且不易变形;用于面包,蛋糕等生产,能使制出的面包,蛋糕等体积膨大,组织细腻,不易掉渣,口感弹性好。褐藻酸亲水性极强,是一种可食而又不易被人体消化的大分子多糖类,它在胃肠里仍具有吸水性、吸咐性、阳离子交换性和凝胶过滤等特性,具有降低人体内的胆固醇含量、疏通血管、降低血液粘度、软化血管等作用, 被人们誉为保健长寿食品。最近对褐藻酸吸收体内锶、镉的效果,及其整肠作用或低热量性能进行评价,褐藻酸果冻在全世界作为膳食食品受到人们重视。McHugh(1987)对褐藻酸在食品方面的应用作了全面综述。基于褐藻酸钙凝胶的重构食品已出现在市场上,如人造海蜇皮、鱼子酱、樱桃、宠物肉制品、洋葱圈和蟹棒等。唯一用于食品的褐藻酸衍生物是藻酸丙二酯(PGA),由Steiner率先制备,后又对工艺进行了改进(1947, 1950)PGA已被用于稳定酸性乳剂酸性水果饮料、果汁鱼肝油的油水乳化、酒类澄清和固定啤酒泡沫等。

褐藻酸盐作为医用辅助材料已经几十年的历史了。除作为传统的外科止血剂、代血浆、创面修复材料、牙科人工印模材料、胃液返流阻碍剂配方成分外,还能减少放射性金属离子在消化道内的吸收,能对欧利希氏(Ehrlich)固形癌有抑制效果,与等分子药物苯丙胺制成有减肥功效的食欲抑制剂等。褐藻酸类似于细胞外基质中的糖胺聚糖GAGs,无亚急性/慢性毒性或致癌性反应,可作为支架材料用于医学用途,具备良好的生物相容性。在给药系统研究中,褐藻酸钠以低细胞毒性、可生物降解性及良好的生物相容性与成膜性等特点,被广泛应用作纳米药物缓释载体。褐藻酸作为胶囊剂, 释放和包埋药物,以其安全、无副作用等优势活跃在制药工业中,微囊化的产激素细胞已经用于糖尿病和甲状腺疾病的临床治疗中(Darquy, 1987; Fan, 1990)。将细胞包埋到褐藻酸钙球体内已经成为活细胞固定化中最为广泛应用的技术(Scott, 1987; Smidsr?d, 1990),该技术在细胞移植方面的潜在应用价值非常巨大。

  褐藻酸衍生物之一褐藻淀粉硫酸酯具有抗凝血、降血脂、抑制血小板聚集、对抗实验动物心肌坏死等作用,是治疗高血脂症冠心病、防止动脉粥样硬化的良药; PSS (propylene glycol alginate sulfate sodium)PGMS (propylene glycol mannuronate sulfate)是两种低分子量褐藻酸衍生物,具有抗氧化性,对缺血性心脑血管疾病及高血粘度综合症有显著疗效,具有明显的抗凝、解痉、解聚、降压、降脂、降低血液粘度及扩张血管、改善微循环的作用(Zhang, 2004)。加拿大Skoryna(1964)首次发现褐藻酸能阻止Sr90在动物肠道内的吸收,并能使其迅速排出体外。Harrison等及Partri(1966)以不同M/G比值的褐藻酸钠投喂已口服Sr90的动物作饲养实验,发现甘露糖醛酸含量高的褐藻酸钠能有效地抑制Sr90在消化道的吸收。次年,Hodgkinson通过人体实验表明,褐藻酸钠能使病人降低Sr85的吸收24倍。褐藻酸钠对放射性元素Ra133Su133Cd109Mn54等也具有阻吸和排除作用。

全球每年褐藻酸盐工业化产出约为30 000t,差不多是每年巨藻类生物合成物总量的10%。挪威的褐藻资源丰富,褐藻胶生产技术也较为先进,年产近万吨。海带是我国产量最高的一种海藻类, 每年大陆约产5~7Mt湿海带,约23万吨干品。随着提碘工业的发展,我国褐藻胶工业也逐步发展起来,并经过几十年的努力,生产工艺和设备也日臻完善。Marinalg亲水性胶体协会的褐藻酸盐生产商成员包括六家公司:中国海藻工业协会(China Seaweed Industrial Association), Danisco Cultor(丹麦), Degussa Texturant Systems(德国), FMC BioPolymer(美国), ISP Alginates Ltd. (英国),以及 Kimitsu化学工业株式会社(日本)。对褐藻酸盐工业来说,原料来源可以说是绝对充足的。截止到今年三月份对全球关于褐藻酸盐的专利和应用进行搜索,已经超过92000例以上,涵盖工医农食多个领域(http://www.freepatentsonline.com/result.html?query_txt=alginate)。可以预期褐藻酸盐未来的市场增长应该更倾向于质而不是量,会向更先进、更高技术、更知识化的应用转变,比如医药卫生用精制褐藻酸盐、微生物藻酸盐、酶异构修饰的褐藻酸盐及具有生物活性高附加值褐藻寡糖的研究开发等(S.De贝特斯,生物高分子),其中褐藻寡糖的研究开拓了功能性褐藻酸的研究新领域,引领了褐藻酸研究新方向,势必会成为未来褐藻酸工业的主要市场之一。 

1.6 褐藻酸的降解

目前对褐藻酸的生物学研究主要放在其降解后的低聚糖的生理活性上。褐藻酸的降解产物——褐藻寡糖及其衍生物具有多种生物活性,如可以作为外源性的诱抗剂(elicitor)促进植物生长,可以促进大麦根的伸长,抑制致病性细菌的生长,作为膳食纤维调节肠胃和血糖,不饱和的低聚糖还可以诱导RAW264.7细胞株分泌肿瘤坏死因子因而具有抗肿瘤活性等(Iizima, 1985; Fujihara, 1992)。尤其当在卡拉胶寡糖中找到了抗病毒的活性成分后,价格低廉的褐藻酸日益受到科研工作者的重视。褐藻酸在人类肠道内不能被降解,不能提供代谢能量。但在一些低等生物体具有裂解功能的酶,可以将褐藻酸降解成寡糖从而作为碳源物质。就目前研究来看褐藻酸盐的降解方法大致可归纳为三类:化学降解法(Aspinall, 1982; Chaplin, 1986; White, 1988)、物理降解法(如直接加热法)和酶解法(Henry, 1967; Romeo, 1986; Shimokawa, 1997; Rehm, 1998)。目前普遍采用的方法是稀酸降解法,但是这种方法需要高温、高压,降解条件难以控制,操作较为复杂。而酶法降解褐藻酸条件温和,过程可控,得率高,绿色安全,环境友好,还可以根据具体目的产物要求选择单一或组合使用不同底物专一性的酶制剂。酶降解应过程中还可以提供序列和构型等方面的信息,所以以酶解法为代表的生物降解必然会逐步取代传统的化学降解,在未来的商业生产中占到优势地位。由此对褐藻酸裂解酶的酶学和机理研究也提出了更高的要求,褐藻酸裂解酶的综合应用研究有着深远的基础理论意义和应用价值。

2. 褐藻酸裂解酶的研究进展

2.1 来源

1931年,大岛等从鲍鱼(Haliotus giganteus)的内脏中首次发现了可以分解褐藻酸的酶,命名为Alginase,又可记作Alginate depolymerases。褐藻酸裂解酶在自然界中的分布广泛,包括在以褐藻酸作为碳源的生物体内,如海洋腹足纲软体动物、棘皮动物体内、海洋和土壤中的原核及真核微生物,以及噬菌体;也可见于一些自身产褐藻酸的海洋藻类和细菌种类中。褐藻酸裂解酶大多为诱导酶,从几种褐藻提取物中可以检测到该酶活性(Shiraiwa, 1975),包括:掌状海带[Laminaria digitata (Madgwick, 1973)], Pelvetia canaliculata (Maki, 1993)和裙带菜[Undaria pinnatifida (Watanabe, 1982)]。也可以从一些软体动物的的内脏腺体(Gut gland),产卵器(style)或肝胰腺(hepatopancreas)中检测到,比如:蝾螺[Turbo cornutus (Muramatsu, 1977)], Littorina spp. (Favorov, 1973), Dollabella auricola (Nisizawa, 1968), 皱纹盘鲍[Haliotis discus hannai(Shimizu, 2003)]Choromytilus meridionalisPerna perna (Seiderer, 1982)。朱仁华(1983)从三种海螺:朝鲜花冠小月螺(Lunella cornatacoreensis)、单齿螺(Monodonta cabio)和疣荔枝螺(Purpura clavigera)中分离得到了褐藻酸裂解酶。目前分离得到最多的还是多种细菌和真菌中的酶,例如:弧菌[Vibrio sp. AL-9(Tseng, 1992a); Vibrio sp. AL-128(Tseng, 1992b); Vibrio alginolyticus ATCC17749(Tseng, 1992c)]、黄杆菌[Flavobacterium multivolum(Toshio, 1994)]Alginovibrio aquatilis(Stevens , 1977; Gacesa, 1992)、固氮菌[Azotobacter sp.(Kennedy, 1992)]、克里伯氏菌[Klebsiella aerogenes(Boyd, 1977); Klebsiella pneumoniae( Caswell, 1989)]、假单胞菌[Pseudomonas aeruginosa(Linker, 1984)]、肠杆菌[Enterobacter cloacae(Shimokawa, 1997)]、交替单胞菌[Alteromonas sp(Sawabe, 1992, 1997 )]、芽孢杆菌[Bacillus circulans(Hansen, 1984)]、真菌Dendryphiella salina (Wainwright, 1980; Shimokawa, 1997)、鞘氨醇单胞菌[Sphingomonas sp(Miyake, 2004)]Agarbacterium alginicums(William, 1962)等。当然由于分类学的原因,先前的一部分假单胞菌属和交替单胞菌属的菌株后来被重新鉴定划分到新的假交替单胞菌属,Pseudoalteromonas属是Gauthier等于1995年根据16SrDNA序列Alteromonas属和Pseudomonas属中分离出来的一个新属(Gauthier et al1995)。目前,Pseudoalteromonas属中已经有34个种存在,这些菌都生活在海洋中,比如Pseudoalteromonas elyakovii IAM 14594 即以前的 Alteromonas sp. strain H4Alteromonas sp. strain No. 272 后来改称Pseudoalteromonas sp. strain No. 272 (Iwamoto, 2002)。另外鲜有报道的是在铜绿假单胞菌[P. aeruginosa (Bartell, 1966)]和棕色固氮菌[Azotobacter vinelandii (Davidson, 1977)]的特异噬菌体中发现有褐藻酸裂解酶,以及在小球藻[Chlorella(Suda, 1999)]病毒中也存在较低同源性的褐藻酸裂解酶基因。

2.2作用机制及分类

褐藻酸裂解酶通过β-消除机制(β-eliminate) 裂解褐藻酸单体间的1-4糖苷键,从而使得高聚物降解成一系列长短不一的寡糖链。并伴随4-O-糖苷键的消除,产物末端六元环C4C5位上会产生不饱和双键,在C5上失去对称性,底物的非还原性末端也会生成4-deoxy-L-erythro-hex-4-enopyranosyl糖醛酸(Haug, 1967a)。不论是D-甘露糖醛酸或L-古罗糖醛酸都生成不饱和衍生物(Preiss, 1962)。不饱和糖醛酸在230240nm处有强烈的紫外吸收,因此酶活力可由此范围内的波长内测定。Gacesa(1987, 1992)描述了褐藻酸酶裂解的三步反应机制。褐藻酸分子中的羧基与酶分子中的碱性氨基酸残基结合,C5位的C-H电子对被6位的羧基吸引,5位的C-H结合变弱,然后又一个酶分子中的亲核性氨基酸残基与C5位的质子结合,电子向着生成稳定的中间体的方向运动,最终在C4-C5间生成双键,所以褐藻酸酶酶解的寡糖均在非还原末端产生C4,5不饱和双键(2)

传统上,褐藻酸裂解酶按其特异性降解褐藻酸盐片段的不同可分为两大类:poly(M) lyase [(1 →4)-β-D-mannuronan lyase ] (EC4.2.2.3) poly(G) lyase [(1→4)-α-L-guluronan lyase] (EC4.2.2.11) ,即专一性裂解1,4糖苷键连接的聚β-D-甘露糖醛酸的裂解酶和专一性裂解1,4糖苷键连接的聚α-L-古洛糖醛酸的裂解酶(Larsen, 2003),它们分别作用于褐藻酸盐的甘露糖醛酸段和古洛糖醛酸段,在非还原末端产生C4,5不饱和双键。

根据一级结构序列分析,多糖降解酶类(polysaccharide lyase, PL)起初被被划分为十三个家族,随着新酶的不断发现增加到现在的十八个家族(families PL-1 to -18) (B. Henrissat, P. Coutinho, and E. Deleury, http://afmb.cnrs-mrs.fr/ cazy/CAZY/index.html)。褐藻酸裂解酶主要被分到PL-5-7两个家族(Miyake, 2004)04),也有特别的零散分布于PL-14-15家族。如从小球藻病毒(Chlorella virus) (Sudae, 1999;Sugimotoe, 2000)、动物(Shimizue, 2003)中分离的一些裂解酶属于PL-14家族;目前Sphingomonas sp.AIAl-IV及其同族物(homolog)被归为新的家族PL-15 (Hashimotoe, 2005)Atu3025来源于Agrobacterium tumefaciens,是外切型褐藻酸裂解酶,是褐藻酸裂解酶PL-15家族的新成员(Ochiai, 2006)。一般的,PL-5家族的褐藻酸裂解酶属于甘露聚糖裂解酶,而PL-7家族的则与古洛聚糖裂解酶范畴大致重合,虽然也有许多降解M-GG-M键的酶, PL-5-7-14家族中褐藻酸裂解酶多属于内切型,而PL-15家族则有不同的作用方式。

目前发现的褐藻酸裂解酶,按照成熟酶分子量的大小,又明显可以分成三大类: 20–35 kDa [30 Mr,包括ALY-1, GenBank AB030481(Matsubara, 2000); A1-I, GenBank BAB03312(Momma, 2000); AlyA, GenBank L19657(Baron, 1994); Aly, AF082561(Sawabe, 2001); Pseudoalteromonas sp. No. 272(Iwamoto, 2002); AlxM, X70036(Malissard, 1993)]40 kDa [40 Mr组,如AcAlgL, GenBank AJ223605; AvAlgL, AF027499; PaAlgL, L09724; PsAlgL, AF222020; HmAL, AB018795; A1-III, BAB03312]60 kDa(Osawa, 2005)40 Mr组的酶特异性裂解甘露聚糖,30 Mr组的酶则有多种底物特异性的裂解酶。随着研究的不断深入,肯定还会有一些新结构和功能的褐藻酸裂解酶被发现,人们对他们的认识也将不断被扩充。

    另外,Chavagnat(1996)Kraiwattanapong(1997, 1999b)根据疏水簇分析法(hydrophobic cluster analysis, HCA)也对当时已发现的褐藻酸裂解酶进行了具体的分类。HCA对于比较分析那些一级序列不是很同源的蛋白是个很有效的方法,因为它不是基于相对分子量的大小,而是氨基酸残基性状、分布等进行分析。当疏水性残基矩阵排列时便形成疏水簇,是典型的α-螺旋二维结构。据此,褐藻酸裂解酶分类如下:(a) HCA class I: ALY1-III (Sphingomonas spp.), AlgL (P. aeruginosa), AlgL ( A. chroococcum), AlgL(A. vinelandii), AlgA (H. marina); (b) HCA class II: AlyP(Pseudomonas sp. OS-ALG-9), AlxM(Photobacterium spp.); (c) HCA class III: AlyA(K. pneumoniae), Aly(P. alginovora), AlyII(Pseudomonas sp. OS-ALG-9)

1-2 (Yamasaki, 2005)褐藻酸高聚物模块位点及褐藻酸裂解酶的降解反应。a.MM模块;b.GG模块;c.MG模块。垂直箭头和平行箭头分别只是裂解位点和反应模式。

2.3 底物特异性

褐藻酸裂解酶的底物特异性是根据其可降解PMPG的偏好不同而定义。底物特异性可能是由产生裂解酶的生物有机体所在的环境决定的,也可能依赖于相对容易获得的褐藻酸盐的类型,即是生物进化过程对环境的一种适应性选择。目前报道的多数裂解酶倾向于利用PM,也有少数PG专一性裂解酶被发现和鉴定[2]。如上所述,PL-5家族的和40 Mr组的褐藻酸裂解酶都对聚甘露糖醛酸有特异性降解,而专一降解聚古洛糖醛酸的酶则多分布于PL-7家族和30 Mr组。大多数褐藻酸裂解酶具有内切酶活性,从高聚物长链内部切断,多数终产物为六糖以内的寡聚体。也有极少数酶有或兼有外切酶活性,可以从褐藻多糖的末端逐步切去单糖或者二糖(Brown, 1991; Doubet, 1982, 1984; Nakada, 1967; Schaumann, 1990Kraiwattanapong, 1999)

研究褐藻酸裂解酶对不同类型底物的特异性,一般应用特殊工艺提取的或者通过体外分子修饰改造的高纯度的PMPG褐藻酸盐,也有采用NMR(Grasdalen, 1979, 1981,1983)TLC(Nibu, 1995)HPLC(Heyraud, 1996; Romeo, 1986; Preston, 1991)FACE((Fluorophonic-asisted carbobydrate electrophoesis)( Shimokawa, 1996)、质谱(Ms)、液-质联用(LC-Ⅱ-MS)、高效毛细管电泳和纸层析等技术分析褐藻酸酶酶解产物,反向推测其底物特异性。

尽管褐藻酸裂解酶被分为M 专一性或G专一性,但是某些酶对非特异性的底物多少还是可以降解的,虽然往往此时活力很低。并且在一些粗酶提取液中发现有多种底物专一性,这表明,生物体可能不止产生一种裂解酶或者该酶对多种类型的底物都有较高的降解能力,当然也不排除实验者所用褐藻酸盐底物并非高纯所造成的误差干扰。Boyen(1990)Chavagnat(1996)都发现海洋铜绿假单胞菌P. alginovora strain X017能产生两种分别具poly(M)poly(G)裂解活性的酶。Sawabe(1992 ,1998)发现交替单胞菌Alteromonas sp. strain H-4利用褐藻酸盐作为惟一碳源,至少产生5 种不同的褐藻酸裂解酶。由于褐藻酸盐结构的复杂,一个生物体产生多种不同或者产生一种同时具有多种底物降解活性的褐藻酸裂解酶,必将会更有利于其对褐藻酸盐的充分利用。

    2.4 酶活力测定

     褐藻酸裂解酶酶活力的定性测定方法,主要用于产酶菌株的初筛,辨别哪些菌株能分泌裂解酶,并可以初步判断该酶活力的大小,有时甚至同时可以用于初步鉴定该酶的底物特异性。所以要求测定方法不一定非常精确,却必须具备高通量的特点,即必须简单易操作。已有定性测定方法的建立,大部分是通过试剂与培养有产酶菌株的固体培养基中未降解的褐藻酸盐或者已降解的褐藻寡糖结合,扩大褐藻酸底物降解前后的视觉差异,使得原本模糊的水解圈呈现清晰的边界。当然高纯度的琼脂在平板检测时会更利于测定结果的观察。Baron(1994)用含有1.5% 琼脂糖和1%G褐藻酸钠的平板检测大肠杆菌中过表达的PG裂解酶的活性,用95%乙醇冲洗平板后,在乳白色浑浊的褐藻酸钠背景下,产酶菌落周围半透明的区带便显现出来。Gacesa(1990)采用西吡氯铵(Cetylpyridinium Chloride)或者钌红(ruthenium red)染色观察水解圈。其他的类似方法还有:使用稀盐酸(Romeo, 1986)、稀硫酸(Takeshita, 1991)或者氯化钙酒精溶液(Schaumann, 1990; Murata, 1993; Hisano, 1994)来沉淀未降解的褐藻酸,或者加入木炭来显现(Chavagnat, 1996; von Riesen, 1980), 或者用酸性条件下结合小牛血清蛋白的方法(Kitamikado, 1990)

我们根据褐藻酸被酶解后会生成大量还原性寡糖而采用了Lugol氏碘液(Lugol's iodine solution)染色的方法(Neuzil, 2002)Lugol氏碘液为法国物理学家J.G.A. Lugol1829年首先配制,含10%的碘化钾、5%的碘酒和85%的双蒸水。培养后的平板用染液浸染片刻后用水冲洗静置,整个褐藻酸背景因为结合了碘分子而呈现碘液原有的棕红色,降解部分生成的大量还原性寡糖则将附着其上的碘原子还原成无色的碘离子,从而使得水解圈呈淡黄色或固体培养基原有的白色,与背景形成强烈的反差(未发表)Lugol氏碘液制取简易,且低毒、弱氧化性、无辐射性,安全易保存。染色过程操作简便需时短,结果视觉效果明显,而且根据透明圈颜色的深浅层次,可初步判定同一菌株所产酶的数量。所以我们相信该方法经进一步完善后在褐藻酸裂解酶或其他类似多糖降解酶的筛选中会被更广泛的应用。

    褐藻酸裂解酶活力定量测定方法的建立,毫无疑问是一个与酶学研究能否开展攸关的基础性问题。对于褐藻酸裂解酶活力的测定,国内外目前尚未有一个统一的标准方法。科研工作者都在试图找寻一种尽量灵敏、稳定、可靠的测定方法,至今已经有许多方法被成功地建立或引入,而它们都存在各自的优点和不足。硫代巴比妥酸法(thiobarbituric acid assay, TBA)是基于酶解产生的不饱和糖醛酸可以和高碘酸反应生成β-甲酰丙酮酸,此中间产物再与硫代巴比妥酸反映的阳性产物可以在548nm下比色定量(Weissbach, 1959; Preiss, 1962; Doubet, 1984; Sawabe, 2001; Preston, 2000; )。该方法比较灵敏且专一,但是存在于培养基中的不饱和糖可以引起很高的背景反映,而且为了得到较好的结果,必须出去粗酶液浓缩过程中加入的硫酸铵以及周质空间提取物中的二糖等。值得一提的是,褐藻酸盐经酸水解后TBA法检测也有阳性反应,说明也生成了不饱和双键,但是无规则的,而且只是部分生成,而酶解反应生成双键却是特有的。另一种比色法苔黑酚法(the orcinol assay)报道较少, 它是赖于碱性条件下褐藻酸的稳定性,短时间的碱处理,终产物寡糖的苔黑酚反应微不足道(Preiss, 1963; Osawa, 2005)。如前所述,酶解产生的不饱和糖醛酸在232nm234nm处有较高的吸收峰,所以可以采用紫外吸收法(Ultroviolet absorption assay)( Boyen, 1990a; Baron, 1994)。此法简单并可对酶解过程中的酶活进行实时监测,但是对实验室的硬件配置要求较高,而且对粗酶液的检测可能存在的干扰因素较复杂。最让人欢喜让人忧的可能要数黏度法(viscometric assay),结果准确,仪器简单,只需要一个玻璃吸管粘度计(Madgwick, 1973)或者毛细管粘度计(Stevens, 1976, 1977),但正如Denault(1978)实验中所遇到的普遍问题,操作繁琐,计算复杂,重复率低,主要的是要求实验人员的操作技术必须娴熟。还原糖法(reducing sugar assay)在国外褐藻酸裂解酶研究中报道较少,但在相关领域葡聚糖酶研究中有所介绍,如Park&Johnson还原糖法(Hedges, 1974)Dygert-Florida-Thoma还原糖法(Doubet, 1978)等。还原糖是指含自由醛基或酮基的单糖和某些具有还原性的双糖。它们在碱性条件下,可变成非常活泼的烯二醇。遇金属离子等氧化剂时,具有还原能力,烯二醇本身则被氧化成糖酸及其他产物。此性质常用于检验糖的还原性,并且常成为测定还原糖含量的各种方法的依据(李建武,1994)。国内研究褐藻酸裂解酶时多借用纤维素酶和淀粉酶研究中的3,5-二硝基水杨酸法(DNS)(韩宝芹,1997;吴永沛,2002)。黄色的3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂与还原糖在碱性条件下共热后,自身被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸,在540nm 波长处有最大光吸收。在一定范围内,反应液里棕红色的深浅与还原糖的含量成比例关系,利用比色法测定其还原糖的生成量就可测定酶的活力。只是DNS法灵敏度不是很高,褐藻酸裂解酶活力普遍偏低,所以使得粗酶液测定中吸光值较低,系统误差变大。

    我们在褐藻酸裂解酶的研究中试用了TBA法、粘度法、UV法和DNS法,而最终采用目前还原糖法中较为灵敏的Nelson-Somogyi(Amano改进型萃取化学公司法)(施特尔马赫, 1992; 张惟杰,1999; 赵昕,1994)。酶解产生的还原性寡糖将铜试剂中的二价铜离子还原成一价铜离子,中间产物氧化亚铜可与砷钼酸试剂生成蓝色的砷钼蓝溶液,该溶液在一定波长下的光密度与还原糖的浓度成正相关。将Somogyi铜试剂法经Nelson(1944)由滴定改为比色后,灵敏度提高到测定范围25-200微克,比DNS法高一个数量级,而且产物稳定,还可以引入九十六孔板微量测定体系实现高通量(Frederick, 1989)。我们结合Somogyi M.(1926,1937,1945a,1945b,1951) Shaffer(1933)Nelson N.的系列文章,订正了配方,合理改进了原有的方法步骤,建立起一套更好的适应于褐藻酸裂解酶活力定量测定的方法(未发表)。该方法方便、快速、灵敏度高,结果稳定,重复性好,适应于不同类型的褐藻酸裂解酶。

 

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