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日志

 
 

Southern blot/Northern blot/Western blot  

2008-07-09 15:44:45|  分类: 專業工作 |  标签: |举报 |字号 订阅

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Southern杂交:

Southern 杂交是分子生物学的经典实验方法。其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上,与标记的核酸探针进行杂交,在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。但由于该技术的操作比较烦琐、费时,所以现在有一些其他的方法可以代替Southern 杂交。但该技术也有它的独特之处,是目前其他方法所不能替代的,如限制性酶切片段的多态性(RFLP)的检测等。

一、基因组DNA的制备(前述)

二、基因组DNA的限制酶切

  根据实验目的决定酶切DNA的量。一般Southern杂交每一个电泳通道需要10-30μg的DNA。购买的限制性内切酶都附有相对应的10倍浓度缓冲液,并可从该公司的产品目录上查到最佳消化温度。为保证消化完全,一般用2-4U的酶消化1μg 的DNA。消化的DNA浓度不宜太高,以0.5μg /μl 为好。由于内切酶是保存在50%甘油内的,而酶只有在甘油浓度<5%的条件下才能发挥正常作用,所以加入反应体系的酶体积不能超过1/10。

    具体操作如下:在1.5ml离心管中依次加入

      DNA(1μg /μl)              20   μg

      10×酶切buffer                4.0 μl

      限制性内切酶(10U/μl)        5.0 μl

      加ddH2O                    至 500  μl

    在最适温度下消化1-3hr。消化结束时可取5μl电泳检测消化效果。如果消化效果不好,可以延长消化时间,但超过6hr已没有必要。或者放大反应体积,或者补充酶再消化。如仍不能奏效,可能的原因是DNA样品中有太多的杂质,或酶的活力下降。

   消化后的DNA加入1/10 体积的0.5M EDTA,以终止消化。然后用等体积酚抽提、等体积氯仿抽提,2.5倍体积乙醇沉淀,少量TE溶解(参见DNA提取方法,但离心转速要提高到12000g,以防止小片段DNA的丢失)。

   如果需要两种酶消化DNA,而两种酶的反应条件可以一致,则两种酶可同时进行消化;如果反应条件不一致,则先用需要低离子强度的酶消化,然后补加盐类等物质调高反应体系的离子强度,再加第二种酶进行消化。

三、基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳

   琼脂糖凝胶电泳是目前分离核酸片段最常用的方法,制备简单,分离范围广(200bp-50kb),实验成本低。下表列举了不同浓度琼脂糖凝胶能分离的DNA片段范围。 

            表:不同浓度琼脂糖凝胶分离DNA片段的范围

琼脂糖凝胶浓度(%)          分离DNA片段范围(kb)

              0.3                           5-60

0.6                            1-20

0.7                          0.8-10

0.9                          0.5-7

1.2                          0.4-6

1.5                                                    0.2-3

2.0                          0.1-2

1. 制备0.8%凝胶:一般用于Southern杂交的电泳胶取0.8%。

2.  电泳:电泳样品中加入6×Loading 缓冲液,混匀后上样,留一或两泳道加DNA Marker。1-2V/cm,DNA从负极泳向正极。电泳至溴酚蓝指示剂接近凝胶另一端时,停止电泳。取出凝胶,紫外灯下观察电泳效果。在胶的一边放置一把刻度尺,拍摄照片。正常电泳图谱呈现一连续的涂抹带,照片摄入刻度尺是为了以后判断信号带的位置,以确定被杂交的DNA长度。

四、DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物

    转移就是将琼脂糖凝胶中的DNA 转移到硝酸纤维膜(NC膜)或尼龙膜上,形成固相DNA。转移的目的是使固相DNA与液相的探针进行杂交。常用的转移方法有盐桥法、真空法和电转移法。这里介绍经典的盐桥法(又称为毛细管法)。

(一)试剂准备

1.变性液:0.5M NaOH;1.5 M NaCl。

2.中和液:1M Tris-HCl(pH 7.4);1.5M NaCl;

3.转移液(20×SSC): NaCl 175.3g; 柠檬酸三钠82.2g,NaOH 调pH 至7.0,加ddH2O至1000ml。

(二)操作步骤

1.碱变性:室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中30min。

2.中和:将凝胶转移到中和液15min。

3.转移  按凝胶的大小剪裁NC膜或尼龙膜并剪去一角作为标记,水浸湿后,浸入转移液中5min。剪一张比膜稍宽的长条Whatman 3mm滤纸作为盐桥,再按凝胶的尺寸剪3-5张滤纸和大量的纸巾备用。按下图所示进行转移。( 转移过程一般需要8-24hr,每隔数hr换掉已经湿掉的纸巾。转移液用20×SSC。注意在膜与胶之间不能有气泡。整个操作过程中要防止膜上沾染其他污物。)

4. 转移结束后取出NC膜,浸入6×SSC溶液数min,洗去膜上沾染的凝胶颗粒,置于两张滤纸之间,80°C烘2hr,然后将NC膜夹在两层滤纸间,保存于干燥处。

五、探针标记

   进行Southern 杂交的探针一般用放射性物质标记或用地高辛标记。放射性标记灵敏度高,效果好;地高辛标记没有半衰期,安全性好。这里介绍放射性标记。

   探针的标记方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法,有一些试剂盒可供选择,操作也很简单。

   以下为Promega公司随机引物试剂盒提供的标记步骤:

1.取25-50ng模板DNA于0.5ml离心管中,100℃变性5min,立即置冰浴。

2.在另一个0.5ml离心管中加入:

       Labeling 5×buffer               10μl

      (含有随机引物)

       dNTPmix                           2μl

       (含 dCTP、dGTP、dTTP 各 0.5mM)

       BSA(小牛血清白蛋白)              2μl

      [a-32P]dATP                       3μl

       Klenow酶                          5U

3.将变性模板DNA加入到上管中,加ddH2O至50μl,混匀。室温或37℃ 1hr。

4.加50μl 终止缓冲液终止反应。

   标记后的探针可以直接使用或过柱纯化后使用。由于a-32P的半衰期只有14天,所以标记好的探针应尽快使用。探针的比活性最好大于109计数/分/μl。

六、杂交

    Southern 杂交一般采取的是液-固杂交方式,即探针为液相,被杂交DNA为固相。杂交发生于一定条件的溶液(杂交液)中并需要一定的温度,可以用杂交瓶或杂交袋并使液体不断的在膜上流动。杂交液可以自制或从公司购买,不同的杂交液配方相差较大,杂交温度也不同。下面给出的为一杂交液配方:

    PEG 6000 10%;SDS 0.5%;6×SSC;50%甲酰胺。该杂交液的杂交温度为42℃。

1.预杂交

    NC膜浸入2×SSC中5min,在杂交瓶中加入杂交液(8cm×8 cm的膜加5ml即可),将膜的背面贴紧杂交瓶壁,正面朝向杂交液。放入42℃杂交炉中,使杂交体系升到42℃。取经超声粉碎的鲑鱼精DNA(已溶解在水或TE中)100℃加热变性5min,迅速加到杂交瓶中,使其浓度达到100μg/ml。继续杂交4hr。鲑鱼精DNA的作用是封闭NC膜上没有DNA转移的位点,降低杂交背景、提高杂交特异性。

2.杂交

    倒出预杂交的杂交液,换入等量新的已升温至42℃的杂交液,同样加入变性的鲑鱼精DNA。将探针100℃加热5min,使其变性,迅速加到杂交瓶中。42℃杂交过夜。

七、洗膜与检测

   取出NC膜,在2×SSC溶液中漂洗5min,然后按照下列条件洗膜:

  2×SSC/0.1% SDS,42℃,10min;

  1×SSC/0.1% SDS,42℃,10min;

  0.5×SSC/0.1% SDS,42℃,10min;

  0.2×SSC/0.1% SDS,56℃,10min;

  0.1×SSC/0.1% SDS,56℃,10min。

   在洗膜的过程中,不断振摇,不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。实践证明,当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时,是洗膜的终止点。上述洗膜过程无论在哪一步达到终点,都必须停止洗膜。洗完的膜浸入2×SSC中2min,取出膜,用滤纸吸干膜表面的水份,并用保鲜膜包裹,注意保鲜膜与NC膜之间不能有气泡。将膜正面向上,放入暗盒中(加双侧增感屏),在暗室的红光下,贴覆两张X光片,每一片都用透明胶带固定,合上暗盒,置-70℃低温冰箱中曝光。根据信号强弱决定曝光时间,一般在1-3天时间。洗片时,先洗一张X光片,若感光偏弱,则再多加两天曝光时间,再洗第二张片子。

   影响Southern杂交实验的因素很多,主要有:DNA纯度、酶切效率、电泳分离效果、转移效率、探针比活性和洗膜终止点等。

七、注意事项

1.     要取得好的转移和杂交效果,应根据DNA 分子的大小,适当调整变性时间。对于分子量较大的DNA片段(大于15kb),可在变性前用0.2M HCl预处理10min使其脱嘌呤。

2.     转移用的NC膜要预先在双蒸水中浸泡使其湿透,否则会影响转膜效果;不可用手触摸NC膜,否则影响DNA的转移及与膜的结合。

3.     转移时,凝胶的四周用Parafilm蜡膜封严,防止在转移过程中产生短路,影响转移效率,同时注意NC膜与凝胶及滤纸间不能留有气泡,以免影响转移。

4.     注意同位素的安全使用。

SOUTHERN BLOT

1. Run the gel as normal. Often for genomic southerns it is desirable to run long gels (18cm) over 4-6hrs.

2. Photograph the gel with a ruler adjacent to the molecular weight markers as a reference.

3. Alkali transfer buffer = 0.5M NaOH (20g/lt), 1.5M NaCl (87.66 g/lt). Prepare 1 litre for one gel and another 750ml for each additional gel. BEWARE This buffer is very dangerous, capable of causing severe eye damage. Use the large volumes involved in this procedure with care and wear protective glasses.

4. Add the gel to 250ml alkali transfer buffer, plus 125ml for each additional gel.

5. Place gel on rocker with buffer solution for 20 mins. NOTE low % agarose gels must be agitated slowly to prevent tearing.

6. Keep remaining 500ml for the transfer tank.

Wear gloves for the following steps

7. Cut 2 pieces of large 3MM paper (wicks) and 2 pieces about 2mm smaller than the gel on each edge and one piece of nylon (Hybond N+, Amersham) the same size as the gel.

Large gel (HFI) Medium gel Mini gel

2 (14 x 19 cm) 2 (15.2 x 10) 2 (9 x 5.2)

2 (14 x 32cm) 2 (15.2 x 32) 2 (18.5 x 5.2)

Cut a stack of paper toweling about 2mm smaller than the gel. The stack needs to be about 6cm thick.

8. Prewet nylon in DDW, then soak in alkali transfer buffer.

9. Add buffer to transfer tank to the level of the platform. Wet the long wicks in transfer buffer and place in the tank.

10. Place gel on platform and spoon on transfer buffer. Add the Nylon and smooth out any bubbles with the back of your finger.

11. Add the 2 slightly smaller 3MM filters, the first prewetted, the second dry.

12. Add the stack of paper towels. NOTE it is very important that the edges of the towel do not touch the wicks that the gel is sitting on or the transfer will be " shortcircuited".

13. Top the stack with a glass or plastic plate and a weight (a bottle with about 200-300ml H2O is ideal). Too much weight compresses the gel and terminates the transfer early.

14. Allow to transfer o/n and then remove the stack carefully. Mark the position of the wells on the filter with a biro (and note position of well #1) before removing the filter. Soak the filter in 0.5M Tris pH 7.5, 1.5M NaCl for 5min. after removal from the gel.

15. Add filter to 200ml 2 X SSC and allow to soak without agitation for 5'.

16. Remove filter and blot dry and bake at 80? for 2hr or place in autoclave for 10' when not operating but warm.

17. Prehybridize with 10ml Aqua. hyb. (Reagents), 1% SDS and 100ug/ml boiled herring sperm DNA for 20-30 minutes (cloned DNA southern) to several hrs (genomic southern).

18. Boil probe for 3' and add to 3ml of fresh hyb solution/SDS/Herring DNA. Squeeze prehyb from the bag and add probe. Seal, avoiding air bubbles and distribute the probe well. Incubate for 4-6hr+ (cloned DNA) to 16-20hr (genomic southern). Washes are performed in 2 to 0.2X SSC, 0.1% SDS depending on homology of probe to target.


Northern Blot
继分析DNA的Southern杂交方法出现后,1977年Alwine等人提出一种与此相类似的、用于分析细胞总RNA或含poly A尾的RNA样品中特定mRNA分子大小和丰度的分子杂交技术,这就是与Southern相对应而定名的Northern杂交技术。这一技术自出现以来,已得到广泛应用,成为分析mRNA最为常用的经典方法。
与Southern杂交相似,Northern杂交也采用琼脂糖凝胶电泳,将分子量大小不同的RNA分离开来,随后将其原位转移至固相支持物(如尼龙膜、硝酸纤维膜等)上,再用放射性(或非放射性)标记的DNA或RNA探针,依据其同源性进行杂交,最后进行放射自显影(或化学显影),以目标RNA所在位置表示其分子量的大小,而其显影强度则可提示目标RNA在所测样品中的相对含量(即目标RNA的丰度)。但与Soughern杂交不同的是,总RNA不需要进行酶切,即是以各个RNA分子的形式存在,可直接应用于电泳;此外,由于碱性溶液可使RNA水解,因此不进行碱变性,而是采用甲醛等进行变性电泳。虽然Northern也可检测目标mRNA分子的大小,但更多的是用于检测目的基因在组织细胞中有无表达及表达的水平如何。
一、 试剂准备
1. 0.5M EDTA: EDTA 16.61g加ddH2O至80ml, 调pH至8.0, 定容至100ml。
2. 50mM NaAc: NaAc 3.4g 加ddH2O至500ml, 加DEPC 0.5ml, 振荡, 37℃过夜,高压灭菌。
3. 5×甲醛凝胶电泳缓冲液: MOPS [3-(N-玛琳代)丙磺酸] 10.3g加50mM NaAc 400ml, 用2N NaOH调pH至7.0, 再加入0.5M EDTA 10ml, 加DEPC H2O至500ml。无菌抽滤,室温避光保存。
4. 20×SSC: NaCl 175.3g、柠檬酸三钠88.2g,加ddH2O至800ml,用2N NaOH调pH至7.0,再用ddH2O定容至1000ml。DEPC处理、高压灭菌。
5. 6×SSC: 20×SSC 300ml加ddH2O至1000ml。DEPC处理,高压灭菌。
6.50×Denhardt : 聚蔗糖0.5g、聚乙烯吡咯烷酮0.5g、牛血清白蛋白(BSA)0.5g加dd H2O至50ml,无菌抽滤、分装。
7.1M Na2HPO4: Na2HPO4?12H2O 35.81g, 加dd H2O至100ml。
8. 1M NaH2PO4: NaH2PO4?2H2O 15.6g, 加dd H2O至100ml。
9. 0.1M 磷酸钠缓冲液(pH 6.6): Na2HPO4 35.2ml加NaH2PO4 64.8ml 。
10.STE缓冲液: 1M Tris-HCl(pH 8.0) 2.5ml,0.5M EDTA, 0.5ml,5M NaCl 5ml,加dd H2O至250ml。
11.预杂交液: 20×SSC 5ml,甲酰胺10ml,50×Denhardt 4ml,1M磷酸钠缓冲液0.2ml(pH6.6),10%SDS 1ml, 总体积 20ml。临用前加入变性鲑鱼精DNA(10mg/ml),使终浓度为4μl/ml。
12. DEPC H2O: 1000mldd H2O中加入DEPC 1ml,充分振荡,37℃过夜,高压灭菌。
二、操作步骤
1. 总RNA提取:见相关内容。
2. 变性胶的制备:取琼脂糖0.2g,加入DEPC H2O 12.4ml,加热熔化,于保温状态下加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0ml、37%甲醛3.6ml,混匀、制胶。待胶凝固后,置1×甲醛凝胶电泳缓冲液中预电泳5min。
3. 样品制备:取总RNA4.5μl(约20-30μg) ,加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液 4.0μl、37%甲醛3.6μl、甲酰胺10μl,65℃温育15min、冰浴5min。加入EB(1μg/μl)1μl、上样缓冲液2μl。
4. 电泳:上样,50V电泳(电泳时间约2hr左右)。电泳结束后将胶块置紫外灯下,观察RNA的完整性,记录18S、28S条带的位置(离加样孔的距离)。
5. 将RNA从变性胶转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜:
(1) 按胶块大小剪取膜一张,用DEPC水中浸湿后,置于20×SSC中浸泡1hr。剪去膜一角。
(2)将胶块切去一角,并在20×SSC浸泡15min×2次。
(3)用长和宽均大于凝胶的一块有机玻璃板作为平台,将其放入大的干烤皿上,上面放一张Whatman 3MM滤纸,倒入20×SSC使液面略低于平台表面,当平台上方的3MM滤纸湿透后,用玻棒赶出所有气泡。
(4)将凝胶翻转后置于平台上湿润的3MM滤纸中央,3MM滤纸和凝胶之间不能滞留气泡。
(5)用Parafilm膜围绕凝胶四周,以此作为屏障,阻止液体自液池直接流至胶上方的纸巾。
(6) 在凝胶上方放置预先已浸湿的尼龙膜,排除膜与凝胶之间的气泡。
(7) 将二张已湿润的、与凝胶大小相同的3MM滤纸置于膜的上方,排除滤纸与滤膜之间的气泡。
(8) 将一叠(5-8cm厚)略小于3MM滤纸的纸巾置于3MM滤纸的上方,并在纸巾上方放一块玻璃,然后用一个重约500克的重物压在玻璃板上。其目的是建立液体自液池经凝胶向膜上行流路,以洗脱凝胶中的RNA并使其聚集在膜上。
6.使上述RNA转移持续进行15hr左右。在转膜过程中,当纸巾浸湿后,应更换新的纸巾。
7.转移结束后,揭去凝胶上方的纸巾和3MM滤纸。将膜在6×SSC中浸泡5 min,以去除膜上残留的凝胶。
8.将凝胶置紫外灯下,观察胶块上有无残留的RNA。
9.膜置80℃,真空干烤1-2hr。烤干后的膜用塑料袋密封,4℃保存备用。
10. 探针标记(Prime-a-Gene Labeling System, Promega公司):
(1) 取模板DNA 25ng于0.5ml离心管中,95-100℃变性5min,冰浴5min。
(2) dNTPmix的制备: 取dGTP 1μl、dATP 1μl、dTTP 1μl混匀。
(3)将下列反应成份混合,加入上述微量离心管中:
dNTPmix 2.0μl
BSA(10mg/ml ) 2.0μl
5×buffer 10.0μl
Klenow 酶(5u/μl) 1.0μl
α-32P-dCTP 5.0μl
加入适量dd H2O使反应总体积达50μl,轻轻混匀。室温下反应1hr。
11.预杂交:将膜的反面紧贴杂交瓶,加入预杂交液5ml,42℃预杂交3hr。
12.杂交:将变性的探针(95-100℃变性5min,冰浴5min)加入到预杂交液中,42℃杂交16hr。
13.洗膜:
(1)倾去杂交液。
(2)2×SSC/0.1%SDS室温洗15min。
(3)0.2×SSC/0.1%SDS,55℃洗15min×2次。
14.压片:将膜用dd H2O漂洗片刻,用滤纸吸去膜上水份。用薄型塑料纸将膜包好,置于暗盒中,在暗室中压上X光片。暗盒置-70℃放射自显影3~7天左右。
三、注意事项
1.操作时必须仔细、小心,严格按同位素操作规程进行,以防止同位素污染。
2.必要时,可采用Sephades G-50柱层析法纯化标记的探针(见本节附录),以去除标记反应中未结合的(游离的)核苷酸。
3.膜的重复使用:结合了待测RNA的膜与探针杂交后,可经碱或热变性方法将探针洗脱,膜可反复使用与其它探针杂交。方法如下:杂交的膜(注意:杂交过的膜在保存过程中不能干燥,否则探针将会与膜形成不可逆的结合)置 100℃ 0.5% SDS中煮沸3min,自然冷却至室温后,将膜放入双蒸水中漂洗2-3遍。取出膜,用滤纸吸去膜表面的水份。将膜直接进行另一种探针的杂交或用保鲜膜包好,室温下真空保存。

 

 

Western Blot

Western Blot中文一般称为免疫着色。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。

免疫著色的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯塔克(George Stark)。在尼尔·伯奈特(Neal Burnette)于1981年所著的《分析生物化学》(Analytical Biochemistry)中首次被称为Western Blot。

原理
Western Blot与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

分类
Western Blot显色的方法主要有以下几种:
i. 放射自显影
ii. 底物化学发光ECL
iii. 底物荧光ECF
iv. 底物DAB呈色
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色,体同水平和实验条件的是用第一种方法,目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行,操作也比较简单,原理如下(二抗用HRP标记):反应底物为过氧化物+鲁米诺,如遇到HRP,即发光,可使胶片曝光,就可洗出条带。

如下网页中有详细的western blot操作说明,从原理到实验过程及注意事项.
http://www.shinegene.org.cn/tools/sg045.pdf

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